BIOKIMIA PROTEIN

PROTEIN

I.                   TUJUAN

1.1  Mengetahui gugus amino bebas pada asam amino

1.2  Mengetahui adanya ikatan peptida dalam suasana basa

1.3  Mengetahui pengendapan protein pada kation-kation logam dalam suasana basa

1.4  Mengetahui interaksi yang distabilkan oleh muatan dan interaksi protein dengan pelarut

II.                PRINSIP

2.1  Uji Ninhidrin   : Berdasarkan pembentukan senyawa aldehid biru

2.2  Uji Biuret        : Berdasarkan pembentukan kompleks Cu²+ dengan gugus –CO dan –NH dari rantai peptida dalam suasana basa

2.3  Uji Pengendapan dengan Logam Berat: berdasarkan pengendapan dengan logam dalam suasana basa

2.4  Titik Isoelektrik Protein: berdasarkan pembentukan endapan/kekeruhan paling cepat yang terjadi dekat titik isoelektrik larutan protein

III.             TEORI

Protein merupakan salah satu unsur terpenting penyusun makhluk hidup. Seperti halnya unsur lainnya seperti karbohidrat, protein juga memiliki sifat  dan fungsi. Sifat-sifat dan fungsi protein ditentukan oleh jenis dan urutan asam amino. Beberapa fungsi utama protein dalam organisme kehidupan antara lain; sebagai bahan penyusun selaput sel dan dinding sel, jaringan pengikat, pembentuk membran sel, mengangkut molekul-molekul lain (hemoglobin) dan sebagai zat antibodi.

Di dalam kehidupan, protein memegang peranan yang penting pula. Proses kimia dalam tubuh dapat berlangsung dengan baik karena adanya enzim, suatu protein yang berfungsi sebagai biokatalisator.

Kita dapat memperoleh protein dari bahan makanan yang banyak mengandung protein, misalnya pada hewan terkandung protein hewani, sedangkan pada tumbuhan terkandung protein nabati.

Protein merupakan polipeptida berbobot molekul tinggi yang terdapat secara alami. Polipeptida yang memiliki hanya asam amino saja digolongkan sebagai protein sederhana. Protein terkonjugasi mengandung komponen bukan asam amino yang dikenal sebagai gugus prostetik di samping kerangka utama asam amino.

Dalam ilmu Kimia, pencampuran atau penambahan suatu senyawa dengan senyawa yang lain dikatakan bereaksi bila menunjukkan adanya tanda terjadinya reaksi, yaitu: adanya perubahan warna, timbul gas, bau, perubahan suhu, dan adanya endapan. Pencampuran yang tidak disertai dengan tanda demikian, dikatakan tidak terjadi reaksi kimia. Ada beberapa reaksi khas dari protein yang menunjukkan efek/tanda terjadinya reaksi kimia, yang berbeda-beda antara pereaksi yang satu dengan pereaksi yang lainnya. Semisal reaksi uji protein (albumin) dengan Biuret test yang menunjukkan perubahan warna, belum tentu sama dengan pereaksi uji lainnya.

Protein adalah molekul raksasa yang terdiri dari satuan-satuan kecil penyusunnya yang disebut asam amino yang tersusun dalam urutan tertentu, dengan jumlah dan struktur tertentu. Molekul-molekul ini merupakan bahan pembangun sel hidup. Protein yang paling sederhana terdiri atas 50 asam amino, tetapi ada beberapa protein yang memiliki ribuan asam amino. Hal yang terpenting adalah ketidakhadiran, penambahan, atau penggantian satu saja asam amino pada sebuah struktur protein dapat menyebabkan protein tersebut menjadi gumpalan molekul yang tidak berguna. Setiap asam amino harus terletak pada urutan yang benar dan struktur yang tepat.

Protein yang terdapat dalam makanan kita dicernakan dalam lambung dan usus menjadi asam-asam amino, yang diabsorsi dan dibawa oleh darah ke hati. Sebagian asam amino diambil oleh hati, sebagian lagi diedarkan ke dalam jaringan-jaringan di luar hati. Protein dalam sel-sel tubuh dibentuk dari asam amino. Bila ada kelebihan asam amino dari jumlah yang digunakan untuk biosintesis protein, kelebihan asam amino akan diubah menjadi asam keto yang dapat masuk kedalam siklus asam sitrat atau diubah menjadi urea. Hati merupakan organ tubuh dimana terjadi reaksi katabolisme maupun anabolisme. Asam amino yang dibuat dalam hati, maupun yang dihasilkan dari proses katabolisme protein dibawa oleh darah ke dalam jaringan untuk digunakan. Asam amino yang terdapat dalam darah berasal dari tiga sumber, yaitu absorpsi melalui dinding usus, hasil penguraian protein dalam sel dan hasil sintesis asam amino dalam sel (Poedjiadi, 1994).

Asam amino adalah monomer protein yang mempunyai dua gugus fungsi yaitu gugus amino dan gugus hidroksil. Jumlah asam amino yang terdapat di alam ada beratus – ratus jumlahnya, namun yang diketahui ikut membangun protein hanya sekitar 20 macam. Sifat asam amino antara lain memiliki titik leleh di atas 200 °C, larut dalam senyawa polar dan tidak larut dalam senyawa nonpolar serta memiliki momen dipol yang besar.

Beberapa Ciri protein sebagai berikut :

1.      Berat moleklnya besar, ribuan sampai jutaan, sehingga merupakan suatu makromolekul.

2.      Umumnya terdiri atas 20 asam amino

3.      Terdapatnya ikatan kimia lain, yang menyebabkan terbentuknya lengkungan-lengkungan rantai polipeptida menjadi stuktur tiga dimensi protein

4.      Stukturnya tidak stabil terhadap beberapa faktor seperti pH, radiasi , temperatur, medium pelarut organik, dan detergen.

5.      Umumnya reaktif dan sangat spesifik, disebabkan terdapatnya gugus samping yang reaktif dan susunan khas stuktural makromolekul.

      Uji Ninhidrin digunakan untuk menunjukkan adanya asam amino dalam zat yang di uji. Uji ninhidrin berlaku untuk semua asam amino. Ninhidrin (2,2-Dihydroxyindane-1,3-dione) merupakan senyawa kimia yang digunakan untuk mendeteksi gugus amina dalam molekul asam amino. 
Asam amino bereaksi dengan ninhidrin membentuk aldehida dengan satu atom C lebih rendah dan melepaskan molekul NH3 dan CO2. Ninhidrin yang telah bereaksi akan membentuk hidrindantin. Hasil positif ditandai dengan terbentuknya kompleks berwarna biru/keunguan yang disebabkan oleh molekul ninhidrin + hidrindantin yang yang bereaksi dengan NH3 setelah asam amino tersebut dioksidasi.

Uji biuret digunakan untuk menunjukkan adanya ikatan peptida dalam suatu zat yang diuji. Adanya ikatan peptida mengindikasikan adanya protein, karena asam amino berikatan dengan asam amino yang lain melalui ikatan peptida membentuk protein. Ikatan peptida merupakan ikatan yang terbentuk ketika atom karbon dari gugus karboksil suatu molekul berikatan dengan atom nitrogen dari gugus amina molekul lain. Reaksi tersebut melepaskan molekul air sehingga disebut reaksi kondensasi.  Uji biuret biasa digunakan untuk uji protein secara umum. Uji biuret akan menunjukkan hasil negatif pada asam amino bebas karena tidak memiliki ikatan peptida.

IV.             ALAT DAN BAHAN

4.1  ALAT             :

1.      Tabung reaksi

2.      Bunsen

3.      Beaker glass

4.      Pipet tetes

5.      Penjepit tabung

4.2  BAHAN         :

1.      Buffer asetat pH 5

2.      2% Amilum

3.      Larutan ninhidrin

4.      Aseton

5.      Aquadest

6.      NaOH 10%

7.      CuSO4 0,1%

8.      Urea

9.      Pb-asetat 2%

10.  HgCl 2%

11.  FeCl3 2%

12.  Kasein 0,5%

13.  Buffer asetat pH 6.0, 5.3, 4.1 dan 3.2

V.                PROSEDUR

5.1  Uji Ninhidrin

Pertama, 0,1ml larutan 2% albumin dimasukan kedalam tabung reaksi dan ditambahkan dengan 0.1N larutan buffer pH 5. Kemudian ditambahkan 20 tetes larutan ninhidrin dalam aseton. Campuran tersebut dipanaskan diatas penangas air mendidih selama beberapa menit.

5.2  Uji Biuret

Didalam tabung reaksi dimasukan 1ml 2% albumin dan 1ml 10% NaOH, kemudian diaduk kuat-kuat dan ditambahkan 1 tetes 0.1% CuSO4, lalu diaduk baik-baik sampai terbentuk warna ungu. Pada tabung reaksi tersebut dimasukan urea sedikit dan dipanaskan hingga melebur. Kemudian didinginkan, dan urea yang telah didinginkan tersebut dilarutkan dengan air lalu ditambahkan 1 tetes CuSO4.

5.3  Uji Pengendapan dengan Logam Berat

1ml albumin dimasukan kedalam tabung reaksi dan ditambahkan tetes demi tetes 0,2% larutan CuSO4 sampai terjadi endapan. Lalu diperhatikan perubahan yang terjadi pada setiap kali penetesan. Percobaan dilakukan kembali untuk larutan 2% Pb-asetat, 2% HgCl2, 2%FeCl3 dan 2% CuSO4

5.4  Uji Titik Isoelektrik Protein

Pada 5 tabung reaksi dimasukan masing-masing 2ml larutan 0,5% kasein. Lalu pada masing-masing tabung tersebut ditambahkan buffer asetat pH 6,0; 5,3; 5,0; 4,1; dan 3,2. Kemudian campuran dikocok baik-baik dan dicatat derajat kekeruhan setelah 0 menit, 10 menit dan 30 menit. Kemudian kelima tabung tersebut dipanaskan dalam air mendidih selama 30 menit.

VI.             DATA PENGAMATAN

1.      Uji Ninhidrin

2.      Uji Biuret

3.      Uji Pengendapan dengan Logam Berat

4.      Uji Isoelektrik protein

VII.          PEMBAHASAN

Pada praktikum kali ini akan dibahas mengenai uji protein. Uji yang pertama adalah uji ninhidrin, sampel yang diujinya adalah albumin, gelatin, kasein dan pepton. Pertama-tama masing-masing sampel dimasukan 0,1ml ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan larutan buffer asetat ph 5,  lalu pada masing-masing tabung reaksi tersebut ditambahkan 20 tetes larutan ninhidrin, kemudian dipanaskan diatas penangas air mendidih selama beberapa menit. Penambahan larutan buffer asetat ini bertujuan untuk menjaga ph dari asam amino tersebut. Karena jika ditambah pereaksi lain, asam amino tersebut akan rusak.

Ternyata didapatkan hasil bahwa albumin dan pepton menghasilkan reaksi positif yaitu terbentuk warna biru. Ini dikarenakan sampel tersebut mengandung gugus a amino bebas, sehingga dikatakan reaksi positif terhadap uji ninhidrin. Pembentukan warna biru in I terjadi karena asam amino bereaksi dengan ninhidrin sebagai oksidator lunak yang menghasilkan hidrindantin, selanjutnya ninhidrin bereaksi dengan hidrindantin dan ammonia membentuk suatu hasil reaksi yang berwarna biru.

Sedangkan pada gelatin dan kasein tidak menghasilkan warna biru karena gelatin dan kasein tidak mengandung sedikitnya satu gugus karboksil dan amino yang terbuka sehingga ketika direaksikan dengan pereaksi ninhidrin tidak menghasilkan reaksi positif.

Yang kedua adalah uji biuret, uji ini adalah untuk mengetahui adanya ikatan peptide dalam suasana basa. Sampel yang diujinya adalah albumin, gliserin, kasein dan pepton. Pada uji biuret ini pertama-tama, masing-masing sampel dimasukan kedalam tabung reaksi dan ditambahkan 1ml NaOH lalu diaduk kuat-kuat, kemudian ditambahkan 1 tetes CuSO4 diaduk baik-baik dan dimasukan urea sedikit kemudian dipanaskan hingga melebur. Ternyata didapatkan hasil bahwa semua sampel positif membentuk ikatan peptide. Biuret ini bereaksi dengan membentuk senyawa kompleks Cu dengan gugus –CO dan –NH pada sam amino dalam protein. Pada uji biuret ini penambahan CuSO4 ini tidak boleh berlebih karena Cu merupakan logam besar. Jika penggunaannya terlalu banyak maka albumin akan terdenaturasi membentuk koagulan. Pada suasana alkalis akan terbentuk Cu(OH)2 dari reaksi Cu²+ + 2OH- → Cu(OH)2 (ungu) Cu²+ berwarna biru intensif, jika berlebihan akan mengakibatkan warna ungu terkalahkan sehingga hasilnya negative.

Yang ketiga adalah uji pengendapan dengan logam berat. Pertama-tama albumin dimasukan kedalan masing-masing tabung reaksi lalu masing-masing tabung tersebut ditambahkan perekasi logam berat (Pb-asetat, HgCl, FeCl3 dan CuSO4) lalu dilihat endapan pada setiap penambahan tetes demi tetes pereaksi logam. Ternyata didapatkan hasil bahwa kation Pb-asetat menghasilkan endapan yang lebih banyak, maka Pb-asetat lebih dapat merusak muatan negative dari albumin. Endapan ini terjadi karena kation-kation dari logam berat dapat merusak muatan negative dari protein sehingga terjadi pengendapan. Dan protein yang tercampur logam berat juga akan terdenaturasi, karena senyawa logam tersebut akan memutuskan jembatan garam dan berikatan dengan protein membentuk endapan logam proteinat. Semakin besar electron valensi pada logam berat tersebut maka semakin banyak pula endapan yang dihasilkan.

Yang terakhir adalah uji titik isoelektrik protein. Pada uji ini sampel yang diujinya adalah kasein. Kasein tersebut dimasukan pada 5 tabung reaksi dan masing-masing ditambahkan ph buffer 6.0, 5.3, 5.0, 4.1 dan 3.2 dan dikocok dengan interval waktu 0 menit, 10 menit, 30 menit dan 30 menit + pemanasan dengan diperhatikan endapannya. Ternyata didapatkan hasil bahwa pada ph 4,1 menghasilkan endapan konstan dari pengocokan 0 menit sampai 30 menit. Pada literature dijelaskan bahwa kasein memiliki ph isoelektrik 4,6.

Titik isoelektrik ini adalah suatu keadaan dimana pada ph tertentu  protein mempunyai muatan positif  negative yang seimbang/ protein dalam muatan netral. Pada ph diatas titik isoelektrik protein akan bermuatan negative sedangkan pada ph dibawah titik isoelektrik protein bermuatan positif, karena protein bersifat amfoter. Yaitu dapat bermuatan positif dan dapat pula bermuatan negative.

VIII.       KESIMPULAN

Dari hasil percobaan ini dapat disimpulkan bahwa:

Uji Ninhidrin         : yang mengandung gugus amino bebas adalah albumin dan pepton

Uji Biuret              : semua sampel positif membentuk ikatan peptide

Uji Pengendapan dengan logam berat      : kation Pb-Asetat lebih dapat merusak muatan negative dari albumin

Uji Titik Isoelektrik Protein                      : titik isoelektrik kasein ada pada ph 4,1 karena pengendapan konstan dari 0 menit sampai 30 menit.

IX.             DAFTAR PUSTAKA

Fessenden danFessenden. 1997. Dasar-dasar Kimia Organik. Binarupa Aksara, Jakarta.

Poedjiadi,Anna. 1994. Dasar-dasar Biokimia, Penerbit : Universitas Indonesia . Jakarta

Sirajuddin, S dan Najamuddin, U. 2011. Penuntun Praktikum Biokimia. Makassar: 

LAMPIRAN

1)      Uji Ninhidrin:

1.      Bagaimana warna dan senyawa yang terbentuk?

2.      Gugus apa yang memberikan uji positif?

Jawab

1.      Warna yang terbentuk adalah warna biru dan senyawa yang terbentuknya adalah hidrindanti dan amonia

2.      Gugus yang memberikan uji positif adalah gugus a amino bebas

2)      Uji biuret:

1.      Warna dan senyawa kompleks apa yang terjadi?

2.      Mengapa harus dihindari kelebihan dari CuSO4?

Jawab

1.      Warna yang terbentuk adalah warna ungu dan senyawa kompleks yang terjadi adalah Cu²+ dengan gugus –CO dan –NH dari rantai peptide dalam suasana basa

2.      karena Cu merupakan logam besar. Jika penggunaannya terlalu banyak maka albumin akan terdenaturasi membentuk koagulan. Pada suasana alkalis akan terbentuk Cu(OH)2 dari reaksi Cu²+ + 2OH- → Cu(OH)2 (ungu) Cu²+ berwarna biru intensif, jika berlebihan akan mengakibatkan warna ungu terkalahkan sehingga hasilnya negative.

3)      Pengendapan dengan logam berat:

1.      Bagaimana terjadinya proses pengendapan protein dengan logam?

2.      Terangkan mengapa putih telur digunakan sebagai antitode pada keracunan Pb atau Hg?

Jawab

1.      Proses pengendapan protein dengan logam ini adalah dengan cara logam tersebut mengikat gugus –CO dari protein kemudian logam tersebut merusak muatan negative dari protein sehingga terjadi pengendapan.

2.      Putih telur digunakan sebagai antitode pada Pb atau Hg karena putih telur mengandung albumin, sehingga apabila tubuh keracunan logam berat maka ion logam berat tersebut akan bereaksi dengan albumin membentuk koagulan sehingga logam berat tersebut tidak akan mengganggu atau merusak aktivitas enzim lain di dalam tubuh.